細胞復(fù)蘇和凍存是細胞培養(yǎng)中常見的操作，主要用于保存和恢復(fù)細胞系。以下是一些基本的步驟和注意事項：
### 細胞凍存（Cryopreservation）
1. **細胞準備**：選擇生長狀態(tài)良好的細胞，通過胰蛋白酶或EDTA等消化細胞，使其成為單個細胞懸液。
2. **細胞計數(shù)**：使用細胞計數(shù)器確定細胞密度。
3. **加入凍存液**：將細胞懸液與凍存液按一定比例混合，常用的凍存液含有DMSO或丙三醇等作為保護劑。
4. **分配細胞**：將細胞懸液分配到凍存管中，通常每管的細胞量是1-2mL。
5. **逐步降溫**：
- 短期保存：可以立即將凍存管放入-80°C冰箱或液氮罐中的凍存盒中。
- 長期保存：通常采用程序降溫機進行逐步降溫，以防止細胞內(nèi)冰晶形成，造成損傷。
6. **儲存**：將凍存管存放在液氮罐中，溫度約為-196°C。
### 細胞復(fù)蘇（Thawing）
1. **準備**：從液氮罐中取出所需的凍存管，快速轉(zhuǎn)移至37°C水浴中。
2. **解凍**：在水浴中輕輕搖動凍存管，直到冰wan全融化。
3. **去除凍存液**：將細胞懸液轉(zhuǎn)移到含有wan全培養(yǎng)基的離心管中，輕輕混合。
4. **離心**：通常以低速（約100-200g）離心5-10分鐘，以沉淀細胞。
5. **去除上清**：小心去除上清液，避免擾動細胞沉淀。
6. **重懸和接種**：將細胞重懸于適量的wan全培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)容器中進行培養(yǎng)。
### 注意事項
- **無菌操作**：整個過程需在無菌條件下進行，避免污染。
- **凍存液的選擇**：不同細胞類型可能需要不同的凍存液配方。
- **細胞密度**：凍存時細胞密度不宜過高，以免影響復(fù)蘇后的細胞活性。
- **解凍速度**：快速解凍有助于減少細胞損傷。
- **復(fù)蘇后的監(jiān)測**：復(fù)蘇后需檢查細胞生長狀態(tài)和污染情況。
細胞凍存和復(fù)蘇的成功與否直接關(guān)系到細胞系的質(zhì)量和長期使用的可行性，因此這些操作需要嚴格遵循標準操作程序（SOP）。